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La "Taq" polymérase (le "copieur" d'ADN):
La PCR se base pour recopier l'ADN sur l’utilisation de la Taq, une enzyme (DNA polymérase) capable de polymériser cad accrocher les bases les unes aux autres pour faire une chaîne. Elle recopie fidèlement le brin d’ADN dés lors que l’ADN est simple brin ou « ouvert » et qu’elle dispose d’une amorce pour s’accrocher et débuter sa « copie ». Cette enzyme provient d’une bactérie (''thermophilus aquaticus'' donc Taq) vivant dans des sources d’eau chaude. L’enzyme a la particularité de ne pas être détruite par la chaleur contrairement à d’autres DNApolymérases ce qui a son importance pour la PCR où on chauffe l'échantillon en cycles jusqu'à une température de 92°C.
L'amorce qui garantit la spécificité de la réaction:
L’amorce est une courte séquence d’ADN simple brin de 20 bases généralement. On choisit un couple d’amorces de façon à encadrer par les amorces la région d’ADN qu’on souhaite amplifier. Une amorce est choisie sur le brin 5’- 3’ et l’autre sur le brin complémentaire 3’- 5’. La taille en nombre de paires de bases du fragment d’ADN encadré par les amorces, qui correspond au fragment qui sera amplifié, est donc connue au départ et dépend du choix de la position des amorces. Les amorces sont choisies dans la mesure du possible de façon à ce qu’elles ne s’accrochent nulle part ailleurs dans le(s) génome(s). Si on veut mettre en évidence le KVH par exemple, il faut choisir les amorces de façon à ce qu'elles s'accrocher non seulement à un seul endroit le virus mais il faut également qu'elles ne puissent s'accrocher nulle part sur le génome de la carpe! Ce n’est pas toujours possible de trouver ce genre d'amorces "parfaites". Cependant, l’amplification PCR ne peut se faire que sur une certaine distance. Celà veut dire qu'il ne faut donc pas choisir non plus des amorces trop écartées et donc chercher à amplifier des segments trop longs d’ADN en une fois. Celà veut aussi dire que si une amorce peut s'hybrider dans un endroit non souhaité du virus ou dans le génome de la carpe mais que l'amorce complémentaire ne peut pas s'accrocher à proximité et dans le bon sens, et bien il n'y aura pas d'amplification "parasite".
Le principe de la réaction en shéma:
On met en solution dans un tube l’échantillon d'ADN à tester (l'ADN a été préalablement extrait des cellules présentes dans le prélèvement fait sur le poisson), la Taq, les amorces, des désoxyribonucléotides et les sels et tampons nécessaires au bon fonctionnement de la Taq.
Accrochage de la Taq
Fin du premier cycle de temperature.
Accrochage de la Taq
Fin du deuxième cycle, le segment d’ADN délimité par les amorces sera désormais amplifié préférentiellement car il est plus court.
Accrochage de la Taq
Ensuite on fait migrer le produit PCR sur un gel d’agarose soumis à une différence de potentiel électrique entre deux éléctrodes. L’ADN est chargé négativement et va donc miger vers le côté du gel proche de l’électrode +. Plus le fragment d’ADN est grand, plus il migrera lentement dans le gel. On fait migrer à côté du produit PCR un mélange d’ADNs de taille connue et de concentration connue qui servira d’étalon pour comparer la taille des fragments d’ADN présents dans notre PCR. Le gel est coloré au bromure d’éthidium et photographie sous lumière UV pour visualiser l’ADN qui a migré sous formes de bandes.
Exemple :
En haut le puit creusé dans le gel où on depose l’échantillon de la PCR. Cinq couples d’amorces différents sont utilisés ici pour amplifier 5 segments d’ADN différents.
Sur l’échelle de taille dans la deuxième piste la bande la plus haute est à 2000paires de bases ou bp (base pair), les suivantes à 1200, 800, 400, 200 et 100. Les bandes du bas sont peu visibles. Ainsi le produit PCR dans la piste 1 et de la piste 3 fait environ 800bp. Celui des pistes 4 et 5 environ 700 et 600 respectivement.
Dans la piste 2 on observe deux bandes alors que le fragment attendu était de 700bp. La bande du haut est donc à la taille attendue. La deuxième est une bande « parasite », signe que nos amorces se sont hybridées ailleurs sur l’ADN, que leur site de liaison n’était pas « unique ». La piste 5 a également une faible deuxième bande et plus bas une troisième bande à peine visible.
Un bonne PCR diagnostique n'aura que la bande attendue à la hauteur attendue.
LMA pour aquatechnobel
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